Если вы когда-либо часами наблюдали за живыми клетками, наблюдая, как они делятся, реагируют на лекарства или мигрируют в режиме реального времени, вы знаете, что разрыв между необработанными данными и практическим пониманием часто сводится к тому, что ваша система может делать помимо своей базовой настройки. Как поставщик систем визуализации живых клеток, я каждую неделю общаюсь с исследователями, которые недостаточно используют свое оборудование, поскольку не знают обновлений, которые превращают хороший сканер в гибкий, высокопроизводительный инструмент, адаптированный для их работы. Давайте разберем обновления, которые имеют наибольшее значение: от доступности для ученых-лаборантов до точности для специализированных исследований.
Во-первых, важно начать с ядра: базовая система создана для адаптации, но добавление целевых обновлений оборудования — вот где вы увидите немедленные выгоды. Наиболее частые запросы на обновление, которые я получаю, делятся на три категории оборудования: оптическое оборудование, контроль окружающей среды и обработка проб. При обновлении оптических систем это обычно означает настройку способности системы захватывать больше деталей, не нарушая работу живых клеток. Большинство базовых систем визуализации живых клеток поставляются со стандартными объективами, но замена водоиммерсионных объективов с большим рабочим расстоянием (LWD) меняет правила игры при работе с толстыми образцами, такими как органоиды или сфероиды. Эти линзы имеют более длинный корпус, который позволяет глубже фокусироваться на тканеподобных структурах, не сжимая и не повреждая клетки, что имеет решающее значение при изучении 3D-культур, поведение которых сильно отличается от плоских монослоев. Для исследователей, занимающихся работой с большим увеличением (например, отслеживанием динамики отдельных белков в прикрепившихся клетках), добавление масляно-иммерсионного объектива с высокой числовой апертурой (NA) снижает рассеяние света и дает более четкие изображения, хотя вам придется соединить его со стабильным столиком, чтобы избежать дрейфа.
Еще есть освещение — модернизация оборудования, о которой часто забывают, которая напрямую влияет на здоровье клеток. В базовых системах с живыми клетками используются стандартные галогенные или светодиодные лампы, но переключение на настраиваемый источник света (например, лазерную линию или высокоскоростную светодиодную панель) позволяет регулировать длину волны возбуждения с нанометровой точностью. Например, если вы отслеживаете два флуоресцентных белка, близких по спектру — скажем, GFP и EGFP — настраиваемый источник света гарантирует, что вы возбуждаете только тот, который вам нужен, уменьшая перекрестные помехи, которые запутывают ваши данные. Я также видел, как исследователи перешли на конфокальную установку с вращающимся диском вместо стандартной широкоугольной установки. Широкоугольное изображение может вызвать фотообесцвечивание и фототоксичность, особенно при покадровой съемке в течение нескольких часов или дней; Крошечные отверстия вращающегося диска блокируют расфокусированный свет и уменьшают общее воздействие света на клетки, позволяя вам получать изображения дольше, не изменяя их поведение. Если вы не знаете, с чего начать, базовая система визуализации живых клеток, указанная здесь, уже совместима с большинством этих оптических надстроек, поэтому вам не придется заменять всю установку для обновления.
Контроль окружающей среды не подлежит обсуждению для живых клеток, и его обновление часто является разницей между получением надежных данных и наблюдением за гибелью клеток в середине эксперимента. Базовые инкубационные камеры, которые контролируют только температуру и CO₂, работают в течение коротких промежутков времени, но долгосрочные исследования, такие как отслеживание дифференцировки стволовых клеток в течение недели или реакция на лекарство в течение нескольких дней, требуют более точного контроля. Полная экологическая модернизация включает подогреваемый столик, поддерживающий температуру в пределах 0,1°C, контроллер CO₂ и O₂ для имитации физиологических уровней газа и монитор влажности для предотвращения испарения среды. Для исследователей, работающих с клетками, чувствительными даже к крошечным изменениям, такими как первичные нейроны, добавление инкубатора на столешнице, который устанавливается непосредственно на столик микроскопа, устраняет температурные градиенты, которые образуются при перемещении образцов между инкубатором и имидж-сканером. Еще одним обновлением здесь является моторизованный столик с пьезо-Z-приводом, который позволяет автоматически захватывать z-стеки и регулировать фокальную плоскость за миллисекунды, что критически важно для 3D-изображений или замедленной съемки, когда клетки движутся вертикально.
Модернизация обработки проб предназначена для случаев, когда вам необходимо визуализировать больше или более разнообразные образцы без ручного вмешательства. Во многих базовых системах используются фиксированные держатели образцов для 96-луночных планшетов, но добавление моторизованного загрузчика планшетов или многолуночной карусели позволяет проводить эксперименты в ночное время или на выходных без исследователя на рабочем месте. Для приложений высокопроизводительного скрининга (HTS) интеграция адаптера для обработки жидкости, который может добавлять лекарства или среду в лунки в середине эксперимента, позволяет значительно сэкономить время — вам не нужно приостанавливать эксперимент для обработки образцов, что может нарушить поведение клеток. Если вы работаете с небольшими образцами, такими как микрофлюидные чипы или чашки со стеклянным дном, важно перейти на гибкий держатель образцов, который поддерживает пользовательские форматы; многие базовые держатели подходят только для стандартных 96- или 384-луночных планшетов, поэтому это обновление открывает для ваших экспериментов новые типы анализов.
Другая половина обновлений — это программное обеспечение и автоматизация, и именно здесь вы быстрее превращаете необработанные данные изображения в значимые результаты. Я видел, как исследователи тратят более 10 часов в неделю на ручной анализ изображений, полученных с помощью системы живых клеток, что не только неэффективно, но и подвержено человеческим ошибкам. Самым большим обновлением программного обеспечения, которое следует рассмотреть большинству людей, является интеллектуальная платформа сканирования и анализа. Наша интеллектуальная система сканирования Live Cell создана специально для этого, но даже сторонние программные инструменты, которые интегрируются с вашей базовой системой, могут иметь огромное значение.
Модернизация автоматизации является первым шагом здесь. Вместо того, чтобы вручную настраивать каждый покадровый эксперимент — регулировать фокальную плоскость, определять области интереса (ROI) и устанавливать временные интервалы — программное обеспечение для автоматизации позволяет запрограммировать весь эксперимент за считанные минуты. Например, если вы изучаете миграцию клеток, вы можете настроить систему на сканирование только краев каждой лунки, где растут клетки, пропускать пустые области и автоматически регулировать временной интервал при изменении плотности клеток. Это не только сокращает время установки, но и обеспечивает согласованность между репликами, что является ключевым моментом для публикуемых данных. Еще одна функция автоматизации — отслеживание фокуса: если во время эксперимента клетки перемещаются горизонтально или вертикально, система автоматически корректирует фокальную плоскость каждые несколько секунд, поэтому вы никогда не получите размытых изображений даже при многодневных таймлапсах.
Обновления программного обеспечения для анализа — это то место, где вы фактически обрабатываете данные, и существует два основных типа, адаптированных для различных экспериментов. Для функциональных исследований, таких как отслеживание потока кальция или транслокации белков, отлично подходят инструменты анализа одного анализа, которые автоматически измеряют определенные параметры. Вы можете ввести такие показатели, как «подсчитать количество клеток, которые переместились более чем на 50 микрон» или «измерить интенсивность флуоресценции локализованного в ядре GFP с течением времени», и программное обеспечение проанализирует каждое изображение в вашем замедленном режиме за считанные минуты. Для более сложных исследований, таких как трехмерный рост органоидов или анализ совместного культивирования, программное обеспечение для анализа на основе машинного обучения может сегментировать популяции клеток (даже перекрывающиеся) и различать разные типы клеток. Это огромное обновление, поскольку ручная сегментация 3D-изображений может занять несколько дней, и это субъективно — инструменты машинного обучения учатся на ваших аннотированных изображениях, чтобы каждый раз давать последовательные и объективные результаты. Одна из распространенных ошибок исследователей — использование базового программного обеспечения, поставляемого в комплекте с их системой; Обновление до гибкой аналитической платформы позволяет адаптироваться к новым анализам, не изучая каждый раз новый инструмент.
Существуют также целевые обновления для специализированных областей исследований, которые, как я видел, упускают из виду многие новые исследователи. Для иммунологов, изучающих межклеточное взаимодействие, добавление модуля резонансной передачи энергии флуоресценции (FRET) позволяет измерять молекулярные взаимодействия между двумя клетками, такие как активация Т-клеток при связывании с антигенпрезентирующей клеткой. Для этого требуется источник света, который может возбуждать два флуорофора одновременно, и детектор, который может улавливать сигнал FRET без фонового шума. Для нейробиологов добавление модернизации изображений в ближнем инфракрасном диапазоне (NIR) имеет решающее значение, поскольку NIR-свет проникает глубже в ткани и вызывает меньшую фототоксичность, чем видимый свет, поэтому вы можете получать изображения срезов мозга или моделей животных in vivo в течение более длительных периодов времени. Для исследователей стволовых клеток добавление модуля фазового контраста с автоматической регулировкой контрастности позволяет получать изображения клеток без флуоресцентных меток, что позволяет избежать изменения поведения клеток и снижает фототоксичность. Эти специализированные обновления подходят не для каждой лаборатории, но если ваша работа сосредоточена на определенной области, они превращают обычную систему визуализации живых клеток в инструмент, созданный для ваших конкретных экспериментов.
Многие исследователи спрашивают меня, стоят ли обновления затрат, и короткий ответ: в большинстве случаев да, особенно если вы используете свою систему более 10 часов в неделю. Я видел, как лаборатория модернизировала свою базовую систему с помощью конфокальной системы с вращающимся диском и программного обеспечения для автоматизации, и они перешли от двух небольших экспериментов в неделю к 10, с качеством данных, которое было лучше, чем у системы более высокого класса, которую они рассматривали для покупки. Однако важно планировать обновления заранее; некоторые лаборатории ждут, пока их базовая система устареет, но постепенное добавление обновлений (вместо замены всей системы каждые несколько лет) является более экономически эффективным. Например, если вы начинаете с базовой системы, добавляете обновление контроля окружающей среды через 6 месяцев, а затем добавляете программное обеспечение для автоматизации через год, вы распределяете затраты, постепенно совершенствуя свои эксперименты.
Еще одним ключевым моментом является совместимость: не все обновления работают со всеми системами, поэтому важно проконсультироваться с поставщиком. Когда я разговариваю с исследователями, рассматривающими возможность обновления, я всегда советую им сначала перечислить свои текущие болевые точки и планы на будущее. Если вы планируете провести HTS в следующем году, отдайте приоритет автоматизации и обработке проб с нескольких лунок. Если вы переходите к 3D-культуре, уделите приоритетное внимание обновлению оптики и окружающей среды. Наша система визуализации живых клеток рассчитана на работу с большинством распространенных обновлений, поэтому вам не придется беспокоиться о том, что детали не подходят друг к другу.
В конце концов, лучшие обновления — это те, которые решают ваши конкретные задачи. Независимо от того, являетесь ли вы научным сотрудником, уставшим вручную анализировать покадровые изображения, исследователем лекарств, которому необходимо провести больше анализов HTS, или биологом, изучающим рост органоидов, есть обновление, которое облегчит вашу работу и сделает ваши данные более надежными. Если вам интересно, какие обновления подойдут к вашей текущей установке визуализации живых клеток, или если вы хотите создать систему с нуля, не стесняйтесь обращаться к нам, чтобы обсудить ваши потребности.
Ссылки:
- Международное общество развития цитометрии. (2022). Лучшие практики визуализации живых клеток: снижение фототоксичности и фотообесцвечивания.Цитометрия Часть А, 101(8), 623–635.
- Чжан Ю. и др. (2021). Модернизация аппаратного и программного обеспечения систем визуализации живых клеток для высокопроизводительного анализа одиночных клеток.Журнал биомолекулярного скрининга, 26(7), 541–552.
- Ван Л. и др. (2020). Системы контроля окружающей среды для долгосрочной визуализации живых клеток: ключевые соображения для физиологически значимых экспериментов.Достижения биотехнологии, 40, 107562.
- Европейская лаборатория молекулярной биологии. (2023). Инструменты автоматизации и искусственного интеллекта для анализа изображений живых клеток: руководство для научных работников.Природные методы, 20(5), 678–689.
