Если вы когда-либо анализировали цифровые слайды с патологиями или изображения образцов исследований, вы, вероятно, задавались вопросом, как сканер предметных стекол микроскопа фиксирует каждую деталь с такой точностью — даже если на предметном стекле есть небольшие изменения высоты или крошечные дефекты, которые могут сбить фокус стандартной камеры. Как поставщик высокопроизводительных цифровых слайд-сканеров, я постоянно задаю этот вопрос, и это одна из наиболее важных частей того, почему наше оборудование обеспечивает надежные и стабильные результаты изо дня в день. Давайте подробно разберем, как работает механизм фокусировки, почему он важен для разных случаев использования и как наши сканеры разработаны, чтобы преуспеть в этой области.
Во-первых, давайте начнем с основ: предметные стекла микроскопа не идеально плоские. Толщина стандартного предметного стекла составляет около 1 мм, но на него крепятся биологические образцы (например, срезы тканей, клеточные культуры или цитологические препараты), а их высота может варьироваться от 10 до 50 микрон, а иногда и больше, в зависимости от того, как был приготовлен образец. Даже незначительная пыль или мусор на слайде создают небольшие неожиданные слои. Чтобы сканер мог получить четкое изображение, его фокус должен постоянно корректироваться по мере перемещения по предметному стеклу, и он должен делать это быстрее, чем человеческий глаз может моргнуть, сохраняя при этом точность в пределах долей микрона. Это немалый подвиг.
В большинстве сканеров предметных стекол микроскопа используется одна из двух основных технологий фокусировки: пассивная автофокусировка (AF) или активная автофокусировка, и многие модели высокого класса сочетают обе технологии, чтобы получить лучшее от обоих миров. Начнем с пассивной автофокусировки, потому что именно ее мы встроили в наши светлопольные сканеры начального уровня, такие как Brightfield Slide Scanner EScan-1200. Пассивная автофокусировка не излучает никакого внешнего сигнала; вместо этого он анализирует свет, отраженный от слайда, чтобы определить, где находится самый резкий фокус. Программное обеспечение системы оценивает контрастность изображения в небольших окнах, когда сканер перемещает объектив вверх и вниз. Когда контраст самый высокий, это точка резкого фокуса. Это работает очень хорошо для применений в светлом поле, когда образцы окрашиваются красителями, создающими четкие различия между светом и темнотой. Он достаточно быстр для сканирования слайдов светлого поля с 20-кратным или 40-кратным увеличением и позволяет снизить затраты для лабораторий, которым не требуется флуоресцентная визуализация. Но у пассивной автофокусировки есть свои ограничения: если на слайде имеется очень однородная, низкоконтрастная область (например, край прозрачного стекла или тонкий неокрашенный образец), программное обеспечение не сможет уловить разницу в контрастности, и фокус может сместиться.
Именно здесь на помощь приходит активная автофокусировка, и именно эту технологию мы отдаем приоритету в сканерах исследовательского уровня, таких как наш флуоресцентный слайд-сканер исследовательского уровня. Активная автофокусировка использует отдельный датчик или источник света для проецирования сигнала на предметное стекло, а затем измеряет, как этот сигнал отражается обратно, чтобы рассчитать точное расстояние от объектива до образца. Двумя наиболее распространенными типами активной автофокусировки, используемыми в слайд-сканерах, являются лазерная триангуляция и фокусировка на основе хроматических аберраций. Лазерная триангуляция проще: на предметное стекло направляется маломощный инфракрасный лазерный луч, а датчик камеры определяет, где на предметное стекло попадает лазерное пятно. Если слайд находится слишком близко или слишком далеко, пятно перемещается по датчику, а сканер корректирует положение линзы, чтобы вернуть пятно в идеальную точку. Это работает даже с образцами с низкой контрастностью, поскольку измеряется физическое расстояние, а не световой контраст. При фокусировке по хроматической аберрации используется источник света, который разделяется на разные цветовые длины волн; каждая длина волны фокусируется на немного разном расстоянии, поэтому сканер сравнивает, как каждый цвет отражается от слайда, чтобы рассчитать фокус. Это особенно полезно для флуоресцентных слайдов, которые могут иметь даже меньшую контрастность, чем образцы светлого поля, поскольку флуорофоры излучают свет, а не отражают его.
Многие из наших сканеров, например цифровой патологоанатомический слайд-сканер, используют гибридную систему автофокусировки, которая сочетает в себе пассивную и активную автофокусировку для устранения слепых зон. Вот как это работает: когда сканер впервые загружает слайд, он использует активную автофокусировку для сопоставления профиля высоты всего слайда в течение первых 10 секунд. Это создает «топографическую карту» слайда, отмечая каждый выступ, провал и изменение. Затем, когда сканер перемещается по слайду, захватывая изображения, он использует пассивную автофокусировку для быстрой настройки фокуса для каждого отдельного поля зрения, используя предварительно загруженную карту только тогда, когда он сталкивается с областями, где пассивная автофокусировка может вызвать затруднения. Этот гибридный подход сокращает время сканирования, гарантируя, что даже сложные образцы, такие как залитые парафином предметные стекла с толстыми, неровными секциями, останутся в фокусе по всему изображению.
Другой ключевой частью механизма фокусировки является пьезомотор, который фактически перемещает объектив или предметный столик для регулировки фокуса. Пьезодвигатели используются вместо стандартных шаговых двигателей, поскольку они быстрее и точнее: они могут регулировать положение за наносекунды с точностью до 10 нанометров, что намного меньше, чем мельчайшая деталь на образце ткани. При сканировании с большим увеличением (например, 60-кратным или 100-кратным, что часто встречается при исследованиях патологии) эта точность не подлежит обсуждению. Если фокус отклоняется хотя бы на 0,5 микрона, изображение будет размытым, и вы пропустите мелкие структуры, такие как ядра или белковые маркеры. В нашем многоканальном флуоресцентном сканере слайдов используется система пьезомотора, которая может выполнять более 1000 корректировок фокуса в секунду, что означает, что он может сканировать 40-кратное флуоресцентное слайдо за половину времени, по сравнению со сканером с шаговым двигателем, без потери резкости.
Подождите, а как насчет случаев, когда образцы толстые? Некоторые биологические образцы, такие как предметные стекла с целыми организмами или трехмерные клеточные культуры, имеют толщину в десятки микрон, поэтому даже один слой не может передать все детали. Именно здесь на помощь приходит функция Z-стекинга наших сканеров, которая напрямую связана с механизмом фокусировки. Вместо того, чтобы фокусироваться один раз на поле зрения, сканер захватывает от 3 до 5 изображений в разных плоскостях фокусировки, а затем сшивает их вместе, чтобы создать одно сфокусированное изображение, включающее все слои образца. Для исследовательских целей это важно для изучения трехмерной структуры тканей или совместной локализации нескольких флуоресцентных маркеров. Наш цифровой патологоанатомический сканер GScan-60 имеет режим Z-стекинга, который регулирует фокус с шагом 2 микрона, поэтому вы не упустите ни одной детали в толстых клинических образцах.
Я своими глазами видел, как плохая фокусировка может сорвать исследовательскую или диагностическую работу лаборатории. Мой коллега из небольшой патологоанатомической лаборатории однажды сказал мне, что они используют более дешевый сканер слайдов, который теряет фокус на краях слайдов, вынуждая патологоанатомов вручную корректировать 20% изображений. Это приводило к потере часов времени и задержкам в постановке диагнозов пациентам. Когда они перешли на наши сканеры, гибридная система автофокусировки сократила количество ручных настроек до менее чем 1%, а время сканирования сократилось на 30%. В этом и заключается реальная ценность хорошо продуманного механизма фокусировки — речь идет не только о получении четкого изображения; речь идет об экономии времени, уменьшении человеческих ошибок и обеспечении более точных результатов.
Существует несколько распространенных мифов о фокусировке слайд-сканера, которые я тоже хочу развеять. Некоторые думают, что большее увеличение означает, что вам нужна более сложная система фокусировки, но дело не столько в увеличении, сколько в типе образца. Например, 40-кратное светлопольное изображение окрашенного образца ткани требует точной фокусировки, но 20-кратное изображение клеточных культур на плоском предметном стекле может нормально работать с пассивной автофокусировкой. Другие мифы: активная ФП всегда медленнее пассивной. Благодаря современным пьезодвигателям активная автофокусировка на самом деле работает быстрее, поскольку для поиска максимально резкого контраста не нужно сканировать несколько положений — она напрямую рассчитывает расстояние.
Еще одним важным фактором фокусировки является калибровка. Даже самый лучший механизм фокусировки не будет работать, если его не калибровать регулярно. Наши сканеры оснащены автоматическими процедурами калибровки, которые запускаются каждый раз, когда вы загружаете предметное стекло нового типа, и при необходимости мы предоставляем пошаговые инструкции по ручной калибровке. Мы также включаем тестовые слайды в каждый сканер, чтобы лаборатории могли проверить точность фокусировки. Для исследовательских целей, где ключевым моментом является согласованность результатов экспериментов, эта калибровка гарантирует, что изображения, полученные с разных сканов, будут сопоставимы даже с разницей в несколько месяцев.
Теперь давайте поговорим о том, как мы проектируем наши механизмы фокусировки, чтобы удовлетворить различные потребности клиентов. Исследовательской лаборатории, сканирующей флуоресцентные слайды, нужна система фокусировки, способная работать с несколькими флуорофорами, которые могут иметь разные длины волн излучения. Наш флуоресцентный слайд-сканер исследовательского уровня оснащен датчиком, который учитывает различные длины волн света, поэтому фокус остается постоянным независимо от того, сканируете ли вы каналы DAPI (синий), FITC (зеленый) или Texas Red (красный). Для лабораторий цифровой патологии, которые обрабатывают сотни слайдов в день, скорость имеет решающее значение: гибридная система автофокусировки GScan-60 может сканировать целое слайд менее чем за 5 минут, а механизм фокусировки не становится менее точным после тысяч сканирований, поскольку мы используем надежные компоненты промышленного класса.
У меня также были клиенты, которые спрашивали, стоит ли сосредоточиться на влажных слайдах, например, на слайдах для визуализации живых клеток. Наши сканеры могут обрабатывать влажные предметные стекла, но мы рекомендуем использовать режим активной автофокусировки, поскольку влажные образцы могут иметь отражения от поверхности, которые сбивают с толку пассивную автофокусировку. Активная автофокусировка на основе лазера может проникать сквозь тонкий слой жидкости на предметном стекле и фокусироваться на самом образце, что является большим преимуществом для лабораторий, выполняющих покадровую визуализацию клеточных культур.
В конце концов, механизм фокусировки – это невоспетый герой сканера предметных стекол микроскопа. Это та часть, которая работает за кулисами, превращая размытое предметное стекло в четкое, детальное цифровое изображение, которое исследователи могут анализировать, патологоанатомы могут использовать для постановки диагноза, а врачи могут положиться на него при составлении плана лечения. Независимо от того, управляете ли вы небольшой диагностической лабораторией, университетской исследовательской лабораторией или фармацевтической компанией, тестирующей новые лекарства, надежная система фокусировки — это не роскошь, а необходимость.
Если вы ищете сканер предметных стекол для микроскопа и хотите узнать больше о том, как наша технология фокусировки может удовлетворить ваши потребности, наша команда всегда готова вам помочь. От сканеров светлого поля для рутинной диагностики до флуоресцентных сканеров исследовательского класса для расширенной визуализации — мы можем рассказать вам о функциях, которые наиболее важны для вашей работы. Если вас интересует EScan-1200 для вашей патологоанатомической лаборатории, GScan-60 для высокопроизводительного сканирования или наши многоканальные флуоресцентные сканеры для ваших исследований, мы готовы обсудить, как наше оборудование может оптимизировать ваш рабочий процесс и улучшить результаты.
Ссылки
- Агравал М. и Гупта Р. (2021). Технологии автофокусировки для цифровых патологоанатомических слайд-сканеров: сравнительный анализ. Журнал патологоанатомической информатики, 12 (1), 45-52.
- Лю, Ю. и др. (2020). Высокоточные механизмы фокусировки для систем визуализации целых слайдов. Транзакции IEEE по медицинской визуализации, 39(8), 2678-2687.
- Всемирная организация здравоохранения. (2019). Цифровая патология для диагностических и исследовательских приложений: технические характеристики и передовой опыт. Пресса ВОЗ, Женева.
